1 范圍：本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了醫(yī)藥工業(yè)無菌室和潔凈區(qū)中浮游菌的測試條件和測試方法。

　　本標(biāo)準(zhǔn)適用于醫(yī)藥工業(yè)無菌室和潔凈區(qū)，無菌室或局部空氣凈化區(qū)域(包括潔凈工作臺)的浮游菌的測試和環(huán)境的驗證。

　　2 引用標(biāo)準(zhǔn)：GB/T 16293?2010

　　藥品生產(chǎn)管理規(guī)范(1998修訂)附錄。

　　3 標(biāo)準(zhǔn)

　　4 測試方法

　　4.1 方法提要

　　本標(biāo)本采用的方法是計數(shù)濃度法。即通過收集懸游在空氣中的生物性粒子于專門的培養(yǎng)基(選擇能證實其能夠支持微生物生長的培養(yǎng)基)，經(jīng)若干時間和適宜的生長條件下讓其繁殖到可見菌落計數(shù)，以判定該潔室的微生物濃度。

　　4.2人員的職責(zé)及培訓(xùn)

　　無菌室的測試人員應(yīng)進(jìn)行本的培訓(xùn)并獲得相應(yīng)的資格后才能才能履行對無菌室測試的職責(zé)，其中包含涉及的衛(wèi)生知識和基本的微生物知識。

　　無菌室的測試人員應(yīng)選擇與生產(chǎn)操作的空氣潔凈度要求相適應(yīng)的穿戴方式，外面的衣服不能帶進(jìn)100000級以上的區(qū)域。

　　4.3 儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基

　　選擇合適的浮游菌采樣器，包括采用無油的抽氣泵，較低的氣流流速和較大的采樣流量，以保證培養(yǎng)基表面的水分布被吹干。

　　本測試需要具備儀器、輔助設(shè)備和培養(yǎng)基如下：

　　a) 浮游菌采樣器;

　　b) 培養(yǎng)皿;

　　c) 高壓消毒鍋;

　　d) 培養(yǎng)基;

　　e) 恒溫培養(yǎng)箱;

　　4.4 浮游菌采樣器原理

　　浮游菌采樣器一般采用撞擊法機(jī)理，可分為夾縫式采樣器、離心式或針孔式采樣器。夾縫式采樣器由內(nèi)部風(fēng)機(jī)將氣流吸入，通過采樣器的夾縫式平板，將采集空氣噴射并撞擊到緩慢的平板培養(yǎng)基表面，附著的活微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)，氣流從才樣器的前部進(jìn)入后部流出，在離心力的作用下，空氣中的活微生物粒子有足夠的時間撞擊到的固型培養(yǎng)條上，附著活的微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落。針孔式采樣器是氣流通過一個金屬蓋吸入，蓋子上是密集的經(jīng)過機(jī)械加工的特制小孔，通過風(fēng)機(jī)將收集到的細(xì)小的空氣直接撞擊到平板培養(yǎng)基表面，附著的活物微生物粒子經(jīng)培養(yǎng)成型后形成菌落。

　　4.5 測試要點

　　4.5.1 必須按照儀器的檢定周期，定期對測試儀器作檢定。應(yīng)使用檢定合格，并且使用有效期內(nèi)的儀器。

　　4.5.2 測試儀器未進(jìn)入被測區(qū)域時，若必需，則先清洗表面吧，或在相應(yīng)的無菌室內(nèi)準(zhǔn)備和存放(用保護(hù)罩或其他適當(dāng)?shù)赝庹直Ｗo(hù)儀器)。

　　4.5.3 在100級無菌室內(nèi)用紙時，上面應(yīng)蒙上一張透明不沾塵的覆蓋物，在100級的無菌室內(nèi)不能用鉛筆的橡皮。

　　4.5.4 使用測試儀器時應(yīng)嚴(yán)格按照說明書操作。

　　4.5.4.1 儀器開機(jī)，預(yù)熱到穩(wěn)定后，方可按說明書的規(guī)定對儀器進(jìn)行校正，同時檢查采樣流量，并根據(jù)采樣量設(shè)定時間。

　　4.5.4.2 采樣口必須用使用便于消毒及化學(xué)性能穩(wěn)定的材料制造。

　　4.5.4.3 采樣管嚴(yán)禁滲漏，內(nèi)壁應(yīng)光滑。

　　4.5.4.4 采樣管的長度應(yīng)根據(jù)測點的高度定，盡量減少彎曲。

　　4.6 培養(yǎng)皿

　　4.6.1 一般采用φ90mm×15mm規(guī)格的培養(yǎng)皿?？筛鶕?jù)所選用采樣器選擇合適的培養(yǎng)皿。

　　4.6.2離心式采樣器采用的固型培養(yǎng)條

　　4.7 培養(yǎng)基

　　大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)或沙氏培養(yǎng)基(SDA)或其他用戶認(rèn)可并經(jīng)驗證的培養(yǎng)基。

　　4.8 恒溫培養(yǎng)箱

　　必須定期對恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行效驗

　　4.9 測試步驟;

　　4.9.1 測試前儀器、培養(yǎng)皿表面必須嚴(yán)格消毒。

　　4.9.1.1 采樣器進(jìn)入被測房間前先用消毒房間的消毒劑滅菌，用于100級無菌室的采樣器

　　宜預(yù)先放在被測房間內(nèi)。

　　4.9.1.2 用消毒劑擦凈培養(yǎng)皿的外表面。

　　4.9.1.3 采樣前，先用消毒劑消毒采樣器的頂蓋、轉(zhuǎn)盤以及罩子的內(nèi)外面，采樣結(jié)束，再用消毒劑輕輕噴射罩子的內(nèi)壁和轉(zhuǎn)盤。

　　4.9.1.4 采樣口及采樣管，使用前必須高溫滅菌。如用消毒劑對采樣管的外壁及內(nèi)壁進(jìn)行消毒時，應(yīng)將管中的殘留液倒掉并晾干。

　　4.9.1.5 采樣者應(yīng)穿戴與被測潔凈區(qū)域相應(yīng)的工作服，在轉(zhuǎn)盤上放入或調(diào)換培養(yǎng)皿前，雙手用消毒劑消毒或帶無菌手套操作。

　　4.9.1.6 采樣儀器經(jīng)消毒后先不放入培養(yǎng)皿，開啟浮游菌采樣器，使儀器中的殘余消毒劑蒸發(fā)，時間不少于5min，并檢查流量并根據(jù)采樣量調(diào)整設(shè)定時間。

　　4.9.1.7 關(guān)閉浮游采樣器，放入培養(yǎng)皿，蓋上蓋子。

　　4.9.1.8 置采樣口于采樣點后，開啟浮游菌采樣器進(jìn)行采樣。

　　4.10 培養(yǎng)

　　4.10.1 全部采樣結(jié)束后，將培養(yǎng)皿倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

　　4.10.2 采用大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA)配制的培養(yǎng)經(jīng)采樣后，在30℃～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不得少于2d;采用沙氏培養(yǎng)基(SDA)配制的培養(yǎng)皿經(jīng)采樣后，在20℃～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，時間不少于5d。

　　4.10.3每批培養(yǎng)基應(yīng)有對照試驗，檢驗培養(yǎng)基本身是否污染?？擅颗x定3只培養(yǎng)皿作對照培養(yǎng)。

　　4.11 菌落計數(shù)

　　4.11.1 用肉眼對培養(yǎng)皿上所有的菌落直接計數(shù)、標(biāo)記或在菌落計數(shù)器上點計，然后用5～10倍放大鏡檢查，有否遺漏。

　　4.11.2 若平板上有2個或2個以上的菌落重疊，可分辯時仍以2個或2個以上菌落計數(shù)。

　　4.12 注意事項

　　4.12.1 使用前應(yīng)仔細(xì)檢查每個培養(yǎng)皿質(zhì)量，培養(yǎng)基及培養(yǎng)皿有變質(zhì)、破損或污染的不能用使用的。

　　4.12.2 對培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件及其他參數(shù)作詳細(xì)記錄。

　　4.12.3 由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大，計數(shù)時一般用透射光于培養(yǎng)皿面或真面仔細(xì)觀察，不要有遺漏計培養(yǎng)皿邊緣生長的菌落，并須要菌菌落或培養(yǎng)基沉淀的物區(qū)別，必要時用顯微鏡鑒別。

　　5 測試規(guī)則

　　5.1 測試條件

　　在測試之前要，要對無菌室相關(guān)參數(shù)進(jìn)行預(yù)先測試，這類測試將會測試懸浮粒子的環(huán)境條件，例如：這種預(yù)先測試或可包括：

　　a) 溫度和相對濕度的測試。 無菌室的溫度和相對濕度應(yīng)與其生產(chǎn)及工藝要求相適

　　應(yīng)(無特殊要求時，溫度控制在18℃～26℃，相對濕度控制在45%～65%之間為宜)。同時滿

　　足測試儀器的使用范圍;

　　b) 室內(nèi)送風(fēng)量或風(fēng)速的測試的測試，或壓差的測試;

　　c) 過濾器的泄漏測試

　　5.1 測試狀態(tài)

　　靜態(tài)和動態(tài)兩種狀態(tài)均可進(jìn)行測試。

　　靜態(tài)測試時，室內(nèi)測試人員不得多于2人

　　浮游菌測試前,被測定無菌室(區(qū))由用戶決定是否需要預(yù)先消毒.

　　浮游菌測試時應(yīng)標(biāo)明測試時所采用的狀態(tài)和室內(nèi)測試人員數(shù)。

　　5.3 測試時間

　　5.3.1 在空態(tài)或靜態(tài)a測試時，對單向流無菌室而言，測試宜在凈化空氣調(diào)節(jié)系統(tǒng)正常運行時間不少于10min后開始。對非單向流無菌室，測試宜在凈化系統(tǒng)正常運行時間不少于30min后開始。在靜態(tài)b測試時，對單向流潔凈是(區(qū))，測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過10min自凈后開始;;對非單向無菌室，測試宜在生產(chǎn)操作人員撤離現(xiàn)場并經(jīng)過20min自凈后開始。

　　5.3.2 在動態(tài)測試時，則須記錄生產(chǎn)開始的時間以及測試時間。

　　5.4.浮游菌濃度的計算

　　5.4.1采樣點數(shù)量及其布置

　　5.4.1.1 少采樣點數(shù)目

　　浮游菌的采樣點位置可參照GB/T16292-2010

　　a)工作區(qū)測點位置離地0.8～1.5m左右(略高于工作面)。

　　b)送風(fēng)口測點位置離開送風(fēng)面30cm左右。

　　c)可在關(guān)鍵設(shè)備或關(guān)鍵工作活動范圍處增加測點。

　　5.4.2 小采樣量

　　浮游菌每次小采樣量見表1。

　　表1小采樣量

　　5.4.3 采樣次數(shù)

　　每個采樣點一般采樣一次。

　　5.4.4 采樣注意事項

　　5.4.4.1 對于單向流無菌室或送風(fēng)口，采樣器采樣口朝應(yīng)正對氣流方向;對于非單向流無菌室，采樣口向上。

　　5.4.4.2 布置采樣點時，至少應(yīng)盡量避開塵粒較集中的回風(fēng)口。

　　5.4.4.3 采樣時，測試人員應(yīng)站在采樣口的下風(fēng)側(cè)，并盡量少走動。

　　5.4.4.4 采取一切措施防止采樣過程的污染和其他可能對樣本的污染。

　　5.4.4.5 培養(yǎng)皿在用于檢查時，為避免培養(yǎng)皿運輸或搬動過程造成的影響，宜同時進(jìn)行陰性對照試驗，每次或每個區(qū)域取1個對照皿，與采樣皿同法操作但不得暴露采樣皿，然后與采樣后的培養(yǎng)皿(TSA或SDA)一起放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，結(jié)果應(yīng)無菌落生長。

　　5.5 記錄

　　測試報告中應(yīng)包含以下內(nèi)容

　　a)測試者的名稱和地址，測試日期;

　　b) 測試依據(jù)

　　c)試無菌室的平面位置(必要時標(biāo)注相鄰區(qū)域平面位置);

　　d)有關(guān)測試儀器及其測試方法的描述：包括測試環(huán)境條件，采樣點數(shù)目及布置圖，測試次數(shù)，采樣流量，或可能存在的測試方法的變更，測試儀器的檢定證書等;若為動態(tài)測試，則還應(yīng)記錄現(xiàn)場操作人員數(shù)量及位置，現(xiàn)場運轉(zhuǎn)設(shè)備和數(shù)量和位置;

　　e)結(jié)果：包括所有統(tǒng)計計算資料。

　　5.6 結(jié)果計算

　　5.6.1 用計數(shù)方法得出各個培養(yǎng)皿的菌落數(shù)。

　　5.6.2 每個測點的浮游菌平均濃度的計算，見式(1)。

　　平均濃度(個/m3)= 菌落數(shù)/ 采樣量??????????????? (1)

　　例1：某測點采樣量為400L，菌落數(shù)為1，則：

　　平均濃度=1/0.4=2.5個/m3

　　例2：某測點采樣量為2m3，菌落數(shù)為3，則：

　　平均濃度=3/2=1.5個/m3

　　5.7 結(jié)果評定

　　5.7.1 每個測點的浮游菌平均濃度必須低于所選定的評定標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于細(xì)菌濃度的界限。

　　5.7.2 在靜態(tài)測試時，若某測點的浮游菌平均濃度過評定標(biāo)準(zhǔn)，則應(yīng)重新采樣兩次，兩次測試結(jié)果均合格才能判為符合。

　　5.8 日常監(jiān)控

　　對于浮游菌的監(jiān)控，宜設(shè)定糾偏限度和警戒限度沿單一方向呈平行流線并且與氣流方向垂直的斷面上風(fēng)速的氣流，以保證無菌室的微生物濃度受到控制。應(yīng)定期以檢查微生物負(fù)荷以及消毒劑的效力，并非作傾向分析。靜態(tài)和動態(tài)的監(jiān)控都可以采用該方法。

　　對于浮游菌的取樣頻率次，如果出現(xiàn)下列情況應(yīng)考慮應(yīng)修改，在評估以下情況，也應(yīng)確定其他項目的檢測頻次：

　　---------------連續(xù)過糾偏和警戒限度;

　　---------------停工時間比預(yù)計延長;

　　--------------生產(chǎn)期間，空氣凈化系統(tǒng)進(jìn)行任何重大的維修;

　　--------------常操做記錄放映出傾向性的數(shù)據(jù);

　　--------------消毒規(guī)程的改變;

　　--------------生物污染等;

　　--------------當(dāng)生產(chǎn)設(shè)備有重大維修或增加設(shè)備時;

　　--------------當(dāng)無菌室結(jié)構(gòu)區(qū)域分布有重大變動時。